中文 EN

singleron@singleronbio.com
02558165529

单细胞转录组测序技术入门

发布时间:2019-04-08 11:43阅读次数:
分享到:

单细胞测序已经成为了科研热点,很多朋友表示想学习却不知怎么入门,接下来就就跟大家分享一下单细胞技术的基础知识吧。

 technologies & libraries

2009年Tang等第一次向大家介绍了单细胞转录组测序技术,但是直到14年随着方法的成熟和测序成本的降低,才逐渐进入大家的视野。它测定的是细胞中每个基因的表达量分布,对于研究特定细胞转录组的变化是重要的,下图展示了单细胞测序的流程和不同的单细胞技术。

微信图片_20200308220502.jpg

单细胞转录组测序流程主要包括单细胞提取,细胞裂解,mRNA反转录,cDNA扩增和文库构建。目前两种主流的单细胞转录组测序技术是SMART-seq2和Drop-seq,两种方法最大的区别在于RNA反转录成cDNA的方法不同,分别是全长mRNA和3’端mRNA测序。

微信图片_20200308220557.jpg


SMART-seq2在包含游离dNTP和带有通用5’锚定序列的oligo(dT)寡核苷酸的缓冲液中裂解单细胞;随后是逆转录的过程,这个反应会在cDNA的3’端添加2-5个无模板的C核苷酸;接着会加入模板转换寡核苷酸(TSO),它携带了两个核糖鸟苷和一个修饰鸟苷,在3’端产生LNA,作为最后一个碱基;在第一链反应后,利用有限的循环扩增cDNA并以扩增出的cDNA快速有效地构建测序文库。

Drop-seq技术会将单个细胞与含有barcode+UMI+ploy(dT)的磁珠包裹在一个凝胶珠(GEMs)中,使细胞标记上特殊的barcode,从而达到单细胞测序的目的。

微信图片_20200308220602.png


因此,SMART-seq2可以得到更多的基因,研究表达量较低的RNA可以选择SMART的全长测序;而Drop-seq捕获到的细胞数量更多,可以进行肿瘤细胞异质性等研究。

微信图片_20200308220607.png


单细胞测序数据通常具有高噪音,有较高的dropout问题,即很多低表达或中度表达的基因无法有效检测到。单细胞转录组测序中RNA总量低,从而产生扩增建库丢失或RNA表达的随机性,这些都是dropout产生的原因。需注意的是,无论采用何种单细胞技术,没有检测到转录本都不能证明该基因没有表达。

primary analysis & data generation

测序结束之后就是数据的分析了,首先对测序数据进行质量控制,可使用fastqc检查测序质量。

微信图片_20200308220612.jpg


经过上一步分析得到clean reads后,我们就可以进行比对和定量。比对的工具主要有tophat, bowtie2, STAR;定量工具主要为RNASkim, eXpress, kallisto, salmon等。

使用STAR软件基于参考基因组和测序数据fastq文件,可生成SAM/BAM格式的比对文件,然后使用FeatureCounts, HTseq等进行定量。而salmon可直接将reads分配到转录本上,能极大的减少计算机资源的使用。后续可对数据进行降维和细胞亚型鉴定,构建单细胞轨迹,做差异表达分析和聚类来揭示重要的基因和细胞等。

experimental and technical biases

单细胞转录组测序技术具有一定的技术局限性,比如数据嘈杂(丢失),低表达的基因可能不能被发现,样品可能被意外的细胞类型污染还有批次效应影响等。因此,在单细胞转录组测序的预处理过程中要充分了解样品的性质(采样条件,制备,纯度),选择适当的平台,并且在对多批次进行任何校正之前需要对单个样品进行单独研究。下图较为详细的展示了单细胞转录组测序技术在实验和数据方面应该考虑的点和一些应对的方法。

微信图片_20200308220617.jpg


好啦,小编的分享就到这里了,不知各位通过本次课程的分享对单细胞转录组测序的了解有没有更上一层呢?


Copyright © 2019 新格元生物科技有限公司.   流量统计